生物3D打印组织中血管分支形成的调控机制

本研究通过3D生物打印技术构建预血管化组织,发现改变聚己内酯(PCL)框架大小可产生不同限制力,进而调控血管分支形成;其中Yes相关蛋白(YAP) 参与该调控过程,且细胞-纤维蛋白条带宽度、力的大小与血管分支数量存在密切关联,表明工程化皮肤组织的血管化是可通过精确机械控制实现的复杂过程。

详细总结:

1.研究背景与目的

背景:血管网络质量是皮肤移植成功的关键,组织工程皮肤因血管化不足易出现缺血坏死,而预血管化是建立高质量血管网络的基础。现有技术难以精准调控血管分支形成,机械刺激被认为是潜在调控手段。
目的:利用 3D 生物打印技术,通过改变框架产生的限制力,调控血管分支形成,建立可控血管分支的组织模型。

2.材料与方法

类别	具体内容
细胞培养	- 细胞类型:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人正常真皮成纤维细胞(HNDFs) - 培养条件:HUVECs 用 EGM-2 培养基,HNDFs 用 DMEM 培养基,均为 3-8 代 - 混合比例:HUVECs:HNDFs=4:1,浓度 5×10⁶ cells/ml,溶于纤维蛋白支架
3D 生物打印	- 设备:BIO X 3D 打印机(Cellink) - 材料:PCL(加热喷头)、明胶和纤维蛋白 - 细胞支架(冷却喷头) - 参数:23G 喷嘴,路径宽 0.35mm、高 0.25mm,速度 100mm・s⁻¹
实验分组	- 对照组:无 PCL 框架 - L6 组:PCL 框架长度 6mm,细胞 - 纤维蛋白条带宽 7.2mm、长 6mm - L10 组:PCL 框架长度 10mm,细胞 - 纤维蛋白条带宽 7.2mm、长 10mm - verteporfin 组:0.5μM YAP 抑制剂处理
检测方法	- 免疫组织化学:CD31、VE - 钙粘蛋白、YAP 等染色,共聚焦显微镜观察 - 扫描电镜(SEM):观察组织微观结构 - qPCR:检测 YAP 下游基因 CYR61 表达 - 动物实验:裸鼠皮下移植,检测血管灌注功能

3.实验结果

血管分支与 PCL 框架的关系:
- L6 组(6mm 框架):血管呈弧形排列,分支数量多(图 2e)。
- L10 组(10mm 框架):血管接近线性排列,分支少或无(图 2c、2e)。
- 对照组:血管分支无规律,长度和分支数显著低于 L6 组(图 2d、2e)。
限制力测量:
- 采用弹簧常数 51.7μN/μm 的微弹簧装置,L6 组限制力约 2.4mN,L10 组约 4.3mN(图 9c)。
YAP 的调控作用:
- YAP 下游基因 CYR61 在 L6 组 6h 时表达高于对照组,verteporfin 处理后显著降低(图 5e)。
- verteporfin 组血管分支数显著多于未处理组,F-actin 排列与限制力方向不一致(图 5c、5d)。

组织特性:
- H&E 染色:L6 组组织厚度显著大于对照组,随 PCL 框架增大,厚度增加(图 6a)。
- Masson 染色:L6 组胶原成熟度优于对照组,框架越大胶原越成熟(图 6b)。
- SEM:L6 和 L10 组细胞排列更紧密,接近正常真皮结构,L10 组细胞沿力方向排列(图 8)。

动物实验:移植 10 天后,新生血管有灌注功能,人源 ECs 形成的管腔中检测到红细胞和 FITC - 葡聚糖(图 S1)。

4.讨论

机械力通过影响细胞骨架(如 F-actin)调控血管形成,框架大小决定力分布,进而影响分支数量。
YAP 作为机械信号转导分子,通过下游基因参与血管分支调控,与 F-actin 活性相关。
本模型为 3D 打印血管化组织提供新方法,但组织力学性能需改进以满足临床需求,力的大小与分支数量的关系需进一步研究。

5.结论

通过改变 3D 生物打印的PCL 框架大小可调控限制力,进而控制血管分支形成。
YAP参与血管分支的调控过程。
细胞 - 纤维蛋白条带宽度、限制力大小与血管分支数量存在密切关联,该技术为构建可控血管网络的组织工程产品奠定基础。

关键问题

问题:本研究中如何通过3D生物打印技术实现对血管分支形成的调控?
答案:研究通过改变聚己内酯(PCL)框架的大小产生不同的限制力(框架越小,力分布呈弧形,分支多;框架越大,力越大,血管越接近线性,分支少),将细胞-纤维蛋白条带固定于框架中,利用细胞收缩与框架抵抗产生的限制力,实现对血管分支形成的调控,无需额外设备。

问题:Yes相关蛋白(YAP)在血管分支形成调控中扮演什么角色?
答案:YAP参与血管分支形成的调控:L6组YAP下游靶基因CYR61表达高于对照组;使用YAP抑制剂(verteporfin)后,CYR61表达降低,血管分支数显著增加,F-actin和血管生长方向与限制力方向不一致,表明YAP通过转导机械信号,影响下游基因表达,进而调控血管分支形成。

问题:本研究构建的预血管化组织在临床应用中有何潜力与挑战?
答案:潜力在于可通过精确机械控制构建具有高质量血管网络的组织工程皮肤,移植后能快速与宿主血管吻合,提高移植存活率,且可用于血管相关药物研发。挑战在于当前组织机械性能不足,难以直接应用于临床;此外,力的大小与血管分支数量的具体量化关系仍需深入研究,以优化组织构建参数。

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